細胞株免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合，原理就是利用抗原-抗體反應之后，采用熒光標記，標記完成后，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少。

從而做出一個定位研究，也可以為細胞內(nèi)信號傳導提供一個明確的指導，細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學技術，也是比較準確的。

一、實驗方法原理

在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。

二、實驗材料

1. 細胞樣品。

2. 試劑、試劑盒：多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton  BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油。

3. 儀器、耗材：玻片。

三、細胞株爬片免疫熒光實驗步驟

1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min。

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟)。

4. PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。

5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜。

6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。

7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。

8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

注意事項

1.取細胞株爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。

2.種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八"字或者“十"字形搖晃，防止細胞局部生長過密。

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